什么是PCR陰性？

舉乙肝的例子來說：通過酶免的方法查乙肝兩對半和通過熒光定量PCR的方法學查乙肝DNA

小明得了肝炎，但他不知道自己得了肝炎，有一天身體不舒服或者正常體檢（比如入職體檢），他去看醫生，臨床醫生懷疑他得了肝炎（肝炎有很多種比如病毒性肝炎，也就是病毒傾入他體內后由于人體的三道防線沒能把病毒消滅掉，導致病毒在人體肝臟內長期繁殖而侵害了肝臟，病毒性肝炎分很多種比如乙肝、丙肝等，患有乙肝的話說明是乙型肝炎病毒侵入了小明的體內導致得了肝炎，有的不是病毒性肝炎比如抽煙等引起的肝炎），回到原來說的，臨床醫生懷疑小明得了肝炎后他會開一個化驗單（項目就是查乙肝5項，也就是我們通常說的兩對半）讓小明去檢驗科化驗下，這時候小明拿著化驗單去檢驗科抽血化驗，檢驗師就會用專用的采血管進行抽血，抽完血以后就會把抽好學的采血管也就是患者樣本進行檢測，最后出來結果，小明乙肝表面抗原陽性，臨床醫生看到化驗結果后就跟小明說他得了乙肝，情況嚴重的話會開藥給小明，讓小明吃一點抗病毒的藥控制乙肝病毒在體內進一步復制，小明吃了一段時間藥以后回來醫院復查，這時候臨床醫生會再給他開一個項目進行檢查，就是熒光定量PCR相關項目，由于小明得的是乙肝所以就查乙肝病毒項目（這里要注意一下為什么小明一開始不是直接查乙肝DNA 而是查乙肝兩對半，這是因為乙肝兩對半是用來確診的也就是兩對半是定性的，查了兩對半之后可以知道小明又沒有得肝炎，因為小明不知道自己得了肝炎所以第一次來查的時候才開兩對半進行檢查確診，但查乙肝DNA是用來跟蹤病情的，說通俗點就是用來了解小明吃的這個藥又沒有用，也就是說乙肝DNA是用來定量的，了解小明體內病毒的含量高低，如果小明吃的藥有用那他的病毒含量會降低，說明病情得到了控制）這就是查兩對半和查乙肝DNA的區別。這個區別也就體現了熒光定量PCR的方法檢測乙肝DNA的意義。乙肝DNA檢測是為了抗病毒治療用的，也就是了解藥物的療效，抗病毒藥物是否起了作用，病毒含量是否降低了。

當然，也可以用定量PCR通過病原學檢測來做乙肝的定性檢測，不過一般說的兩對半是指酶免方法。

在新冠病毒的檢測中，因為最早還沒有出現酶免方法，所以直接用熒光定量PCR來進行病原學檢測。PCR陰性即從病原學角度證明，沒有得病。當然，由于各種原因，PCR檢測也會出現假陰性，現在的手段是對疑似多做幾次試驗，比如2次、3次。

附錄：

PCR檢驗室常規項目簡介

1. 乙型HBV-DNA定量

HBV-DNA定量檢測方法的出現從根本上突破了免疫學方法間接檢測的局限性，通過直接檢測病毒的核酸水平真實地反映病毒的情況從而對于HBV的準確診斷、有效治療、精確預后及新藥研制等各個方面具有重大意義：

1）判斷疾病的嚴重程度和傳染性。HBV-DNA是直接反映HBV復制狀態及傳染性的最佳指標。

2）PCR定量結果與血清免疫學結果的綜合評價。采用FQ-PCR定量檢測乙肝病毒DNA，結合“二對半”檢測結果，對于機體乙肝病毒感染狀態尤其變異株發生和病人預后的評估更為科學。

3）觀察抗病毒藥物療效，指導藥物用量。直接檢測血清中的HBV-DNA是監控HBV傳染和觀察抗病毒藥物療效的最可靠的方法。根據《2000拉米夫定臨床應用指導意見》，中國慢性乙型肝炎病人治療的目的之一就是要降低血清HBV-DNA。同時血清HBV-DNA滴度的動態變化還可在臨床上對用藥的劑量、用藥時間是否需要聯合用藥以及用藥的效果等提供參考。

4）獻血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷。HBsAg在血清中的檢出通常在乙肝病毒感染后的2－4月出現，平均為56天左右。而HBV-DNA的檢出可以將該所謂″窗口期″提前6－15天，對于早期診斷和提高輸血安全有著重要的意義。

5）預測病情、判斷預后。通常HBV-DNA持續陽性超過6個月的會轉為慢性肝炎。抗－HBe陽性患者血清HBV-DNA持續陽性常提示肝損嚴重。

6）對阻斷母嬰傳播的監測。聯合應用高價免疫球蛋白和乙肝疫苗有效地阻斷母嬰傳播，但仍有5-10%嬰兒對疫苗呈低反應，熒光定量PCR可對此進行監測。

7）器官移植中的作用。肝臟器官移植是目前肝硬化晚期治療的唯一方法，定量檢測HBV-DNA為肝移植術后的跟蹤觀測具有較好的臨床價值。

乙肝病毒定量相關檢測還有：乙肝標志物定性，乙肝標志物定量，乙型HBV-DNA定量，肝臟功能檢測。

2. 乙型HBV-DNA定性

HBV-DNA是乙肝病毒基因，其有無、多少是乙肝病毒存在及有無復制能力的直接標志。早期診斷乙肝病毒感染的直接證據，提高乙肝病毒檢測的陽性率，用于乙肝病毒治病機理的研究，作為乙肝病毒分子流行病學研究。

乙肝病毒相關檢測還有：乙肝標志物定性，乙肝標志物定量，乙型HBV-DNA定量，肝臟功能檢測。

3. 丙肝病毒RNA定量

HCV RNA定量檢測有助于預測、監測抗病毒治療的效果，HCV病毒核酸的定量檢測在一定程度上能反應肝臟炎癥活動程度，分析抗病毒治療后HCV RNA血清水平有助于總結抗病毒制劑的療效，為調整劑量、確定療程提供依據。

丙肝病毒相關檢測還有：丙肝抗體檢測，肝臟功能檢測。

4. 結核桿菌DNA定性

根據臨床表現，常規痰涂片或分離培養對某些結核病人可能造成誤診或漏診。熒光PCR理論上可檢出一個結核桿菌，特異性好，且時間短至1-2小時即可出報告。可以對結核病人早期診斷，可以鑒別診斷肺結核和肺癌。作為抗癆治療的療效評價；結核病的分子流行病學研究。

結核桿菌的相關檢測還有：結核抗體檢測，ADA，結核桿菌芯片檢測，抗酸染色，OT試驗，PPD試驗，放免分析，結核培養。

5. HPV基因分型

宮頸癌是人類所有癌癥中唯一病因明確的癌癥，即人乳頭瘤病毒的感染是宮頸癌發生的必要條件和主要病因，99.7%的宮頸癌患者都能發現高危型HPV感染，從HPV感染到宮頸癌的發生需要經過多年甚至數十年的時間，這為宮頸癌篩查指明了方向。因此早期定期進行HPV感染的篩查，對預警癌變傾向，及時發現、預防和早期診斷及臨床治療具有非常重要的意義。

相關檢查項目：組織原位雜交，基因芯片技術，液基細胞學試驗

6. 乳頭瘤病毒DNA定性

HPV16，18病毒DNA通常整合到人基因中，可能是宮頸癌的啟動癌基因，對于婦產科的防癌普查有指導意義，而HPV6.11常可誘發良性濕疣或宮頸糜爛。因此，HPV的檢查非常重要。

相關檢查項目：組織原位雜交，基因芯片技術，液基細胞學試驗。

7. 梅毒螺旋體DNA定性

FQ-PCR檢測人體不同來源標本中TP-DNA的結果，實際上是反映了梅毒螺旋體在這些部位的載量及其消長規律。梅毒血清學檢查比如RPR、TPPA，是診斷各期梅毒最常用的實驗室檢查手段，但其陽性結果不代表體內有活的TP存在。

相關檢查項目：RPR、TPPA、TPHA

8. 淋球菌DNA定性

傳統的涂片、培養等方法，靈敏度不高，女性病人檢出率僅50%淋球菌感染，男性可發生尿道炎。女性可引起尿道炎及子宮頸炎。不經治療或治療不徹底，可致慢性感染。胎兒經產道時，可感染淋病性急性結膜炎。因此，在淋病的早期診斷，對該病有重大意義。

淋球菌相關檢查項目：淋球菌培養，涂片革蘭氏染色，基因探針技術。

9. 沙眼衣原體DNA定性

非淋球菌感染的尿道炎、宮頸炎、子宮內膜炎、急性輸卵管炎及盆腔炎，有超過50%是由沙眼衣原體感染所致，同時可引起不孕不育。因此，在婦產科和男性生殖泌尿科，同時檢測UU和CT很有必要。可致沙眼、成人和新生兒包涵體結膜炎。

沙眼衣原體相關檢查項目：細胞培養，免疫熒光法，沙眼衣原體抗體檢測。

10. 解脲支原體DNA定性

解脲支原體在非淋球菌性尿道炎中，有50%是由本病引起的。如果孕婦生殖道帶有解脲支原體，可通過胎盤感染胎兒引起早產、死胎，分娩時可引起新生兒呼吸道感染。另外還可導致不孕不育。因此，婦產科普查解脲支原體有很重要的意義。

相關檢查項目：解脲支原體培養，解脲支原體抗體,生長抑制試驗,代謝抑制試驗。

11. EB病毒DNA定性

EB病毒屬于皰疹病毒，可引起增殖性感染和非增殖性感染。特別是非增殖性感染，可導致細胞癌變。被認為與傳染性單核細胞增多癥。淋巴癌、胃咽癌、何杰金氏癌、慢性疲勞綜合癥有關。

相關檢查項目：EB病毒特異性抗體或異嗜性抗體凝集試驗。

12. 單純皰疹病毒DNA定性

HSV-1型：主要侵犯口、唇的皮膚黏膜，可引起腦炎，偶爾可見于外生殖系統。HSV-2型：一般與外生殖系感染和新生兒感染有關。可引起臟器的病變（包括腦炎）偶見于口腔病變。

相關檢查項目：單純皰疹病毒抗體檢測。

13. 肺炎支原體DNA定性

肺炎支原體是原發性非典型肺炎和急性呼吸道感染的病原體，尤其是兒童和青少年中常見。常在軍營和中小學生中流行。每隔3-5年流行一次。許多患者癥狀較輕，只有頭疼、發熱、咳嗽等呼吸道癥狀，也有個別引起死亡的報道。有時合并中耳炎、心血管、神經癥狀和皮疹。肺炎支原體感染是在治療上與其它微生物感染是治療不盡相同，為避免濫用抗生素，應早期、快速、準確的檢測肺炎支原體。

相關檢查項目：肺炎支原體抗體檢測；補體結合試驗；肺炎支原體培養。

14. 幽門螺旋桿菌DNA定性

幽門螺桿菌感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織（MALT） 淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年世界衛生組織/國際癌癥研究機構（WHO/IARC） 將幽門螺桿菌定為Ⅰ類致癌原。現在PCR可通過鼻胃管收集5ml胃液作PCR檢測。采用膠囊包裹的尼龍線取胃液標本的方法，使這一診斷性試驗的侵入性更小。

相關檢查項目：C13/C14呼吸法；血清學檢驗。

15. 腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型RNA定性

這兩個病原體是引起手足口病的主要病原體。而手足口病多發生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥。個別重癥患兒如果病情發展快，導致死亡。

附錄：

PCR實驗的常見問題

PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚至消失。

假陰性

不出現擴增條帶。PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及溴乙錠的使用， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。 

陰性

需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質

降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 

假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶：

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現片狀拖帶或涂抹帶：

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。