人類滑膜原代細胞培養步驟和體會

1、將切下的組織在手術臺上請護士將標本放入低溫生理鹽水中（可不要動它），在手術完成時將標本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實驗室；

2、在超凈臺中將標本放入培養皿中，加入α-MEM洗滌；

3、獲得組織切開，仔細辨認于關節反折處及增生的白色光滑的滑膜組織，附于關節軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織（可作另一管消化），仔細剔除脂肪組織，用α-MEM洗二次（以去除紅細胞），放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎

4、用雙倍獲得組織的體積含有4mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘（在此期間震動混勻數次）；

5、30分鐘后收集第一管細胞：細胞懸液經70μm細胞濾網過濾，用1500-2000轉離心6分鐘，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過濾網的組織，繼續用于消化；

6、離心管底細胞用α-MEM離心洗滌2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉，離心6分鐘，最后一次用記數板觀察到有細胞。細胞最終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接種到培養瓶中培養。

7、60鐘后收集第二管細胞：細胞懸液經70μm細胞濾網過濾，用1500-2000轉離心6分鐘；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉離心6分鐘，最后一次用記數板觀察細胞并計數。細胞最終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接種到培養瓶中培養。

8、必要時可做第三管細胞收集；并立即作原代滑膜細胞培養。

9、每2-3天換液一次。

體會：

1、雖然國內外文獻有組織塊培養法獲得滑膜細胞，但我試過，沒有獲得滑膜細胞，可能方法沒掌握好或實驗條件不同；

2、我探索過用0.25% trypsin或0.25% trypsin＋ 0.02%EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化細胞或合用，只有單用collagenaseⅠ有用、最好；

3、機械法很難獲得細胞；

4、全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用國產即可

5、必須用Ca－free的PBS。