人類外周血染色體制備

實驗概要

人外周血小淋巴細胞，通常都處在G1期（或G0期），一般情況下不進行分裂。如在培養液中加入植物血凝素（PHA），這種小淋巴細胞受到刺激可轉化為淋巴母細胞，進入有絲分裂。短期培養后，經秋水仙素處理，低滲和固定，即可得到大量的有絲分裂細胞。人體的1ml外周血內一般含有約1×10⁶～3×10⁶個小淋巴細胞，足夠染色體標本制備和分析之用。

主要試劑

1. RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO₃ 2.0克/1000ml以緩沖pH。完全溶解后經0.22 μm滅菌濾膜抽濾除菌。

2. 肝素鈉（肝素）：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，15磅20分鐘滅菌。

3. 秋水仙堿（秋水仙素〕，生理鹽水配制成10μg/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置－20℃。

4. 低滲液：0.35％KCl。

5. 固定液（Carnoy固定液） 甲醇∶冰乙酸（3∶l），臨時配制。

6. Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時配制。

7. 磷酸緩沖液：1/15M Na₂HPO₄、1/15M KH₂PO₄等體積混和。

8. 5% NaHCO₃滅菌濾器抽濾備用。

主要設備

5ml注射器（7號針尖），培養瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20分鐘。離心管、吸管、量筒、載玻片，經洗液按常規清洗、烘干備用。

超凈工作臺，恒溫培養箱，天平，離心機、顯微鏡等。

實驗步驟

1. 細胞培養

1) 培養基的配制：

在超凈工作臺中，100ml培養基含以下成分和比例：

RPMI-1640 84ml

小牛血清 15ml

PHA 3支

肝素鈉 1ml

卡那霉素 終濃度為100單位/ml

以5% NaHCO₃（無菌）或1N HCl調pH至7.2－7.4。

用刻度吸管將培養液分裝入培養瓶（10ml/瓶），4℃備用。

2) 采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3—0.5ml，立刻將注射針直接穿過培養瓶的橡膠塞，向10ml培養基中注入30—40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養。

3) 培養：時間為68小時。培養期間，定期輕搖勻，使細胞充分接觸培養基。

4) 秋水仙素處理：終止培養前2—4小時，在培養液中加入秋水仙堿（用1ml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0.07μg/ml）。

2. 染色體制備

1) 收集細胞：將培養物全部轉入潔凈離心管中，以1000rpm離心8—10分鐘，棄上清液。

2) 低滲處理：向刻度離心管中加入預溫37℃的低滲液8ml，用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15—25分鐘。

3) 預固定：低滲后加入0.5ml固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8—10分鐘。

4) 一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。

5) 二固定、三固定：同一固定。

6) 制懸液：棄上清液后，視細胞數量多少加入適量固定液制成細胞懸液。

7) 滴片：吸取細胞懸液自10—500px高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。

8) 染色：1:10 Giemsa染色5—10分鐘，細水洗去多余染液，氣干。

9) 鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態并計數。