人末梢血微量全血培養染色體顯示法

實驗概要

        人末梢血微量全血培養染色體顯示法

實驗步驟

1．培養液準備：取15ml培養瓶數個，每瓶內分別充入5ml培養液（pH 7.2），內含：1640培養液（含10％～15％小牛血清），PHA 0.1ml，青霉素100單位和鏈霉素100微克/毫升 培養液

2．抽血針管準備：取2～5ml針管一支，在消毒后的無菌操作臺或無菌操作箱中安裝好注射器，無菌抽肝素（100 U/ml BBS）少許濕潤針管，如動作迅速不用肝素亦可。

3．采血：用棉簽75％酒精給患者或獻血者的皮膚消毒兩次，縛止血帶，靜脈取血1～2ml。無菌操作迅速向每一瓶培養中加血0.4～0.5ml，如系外出采血，安裝針管及分裝血液兩步驟亦可在無菌條件略差的環境內操作，但動作要迅速，以減少污染；在采血量不多或不應抽血的情況下，亦可在耳垂、手指肚（無名指）用刺血針采血。

4．培養和加秋水仙素：37℃溫箱中培養到60～72小時之間，此時細胞分裂相最多，向每培養瓶內加秋水仙素，最終濃度0.02～0.08微克/毫升營養液，再培養4～6小時。

5．低滲：1000轉/分鐘離心10分鐘，吸除上清液，加入預溫過的0.075M KCl溶液10ml，置溫箱中低滲處理15～20分鐘。

6．預固定：向懸液中加新鮮1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打調勻，此措施能起到先使細胞表面輕微固定，可防止固定后細胞粘連成塊。

7．固定：離心，同4，吸除上清液，加新鮮固定劑5～10ml；加固定劑時要用一手微斜持離心管，另手用吸管吸取固定劑，把固定劑逐滴滴在離心管壁上，使之慢慢流入離心管中，然后輕輕吹打均勻，置15～20分鐘。

8．重復7，末次離心后，小心吸除大部分上清，據懸液中細胞密度大小，余下固定液0.5～1ml。

9．制片：用滴片法制片，按如下步驟：徹底洗凈載物片，勿留任何油脂，置冰箱中儲備備用。滴片前現從冰箱中取出冷載物片1片，在載物片表面出現細微水氣時，立即向片的一側滴2～3滴細胞懸液，滴片時的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥，或用吹風機熱風吹干亦可。如此制備好的標本可置盒中備用或立即進行染色觀察。

10.染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸緩沖液9份混合，染色10分鐘后，水洗、晾干、可直接觀察。如標本需要
       保存或做長時間觀察，可過二甲苯兩次后，用中性樹膠封片后，再過二甲苯，然后封片亦可。