乙肝患者外膜蛋白血清學檢測及對于判定HBV DNA復制的意義

目的  探討HBV感染者血清中PreS1-Ag、PreS2-Ag、大蛋白（LP）的檢測意義及其對判定HBV復制的意義。

方法 應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測201例HBV感染血清的PreS1-Ag、PreS2-Ag、HBV-LP及HBV M，同時應用熒光定量PCR方法檢測HBV DNA。

結果 PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg陽性率差異有統計學意義，PreS2-Ag、LP檢出陽性率均高于HBeAg；LP的檢出陽性率與HBV DNA的檢出陽性率相關性有統計學意義，且HBV DNA拷貝數的對數值與HBV-LP表達呈正相關。

結論 PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP較準確的反映乙肝病毒的復制情況，是HBV M有益的必要補充；血清中HBV-LP的含量與HBV DNA的拷貝數具有較好的相關性。

【主題詞】肝炎，乙型；肝炎病毒，乙型；肝炎抗原，乙型；病毒包膜蛋白；遺傳標記

Significance  of hepatitis B virus PreS1-Ag, PreS2-Ag, large protein, PreS2-Ab  detection and the prediction of HBV DNA replication MAO Yuan-li , LI Bo-an , MA Hong-bin , SUN Zhi-qiang , SHI Jia-bin , LI Xiao- han, XU Jun, WANG Xue-fei, YANG Li-hua（ Center of Clinical Laboratory, The No. 302 Hospital of The People＇s Liberation Army, Beijing 100039, China ）

[Abstract:]  Objective To explore the significance of hepatitis B virus PreS1-Ag, PreS2-Ag, large protein （LP） detection and the prediction of viral replication. Methods PreSl-Ag, PreS2-Ag, LP, and HBV markers were measured by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） in 201 cases of infected serum. Serum HBV DNA level was quantitatively detected by real-time polymerase chain reaction （PCR）. Results  There were significant differences in positive rate between the  PreS1-Ag, PreS2-Ag, LP, and HBsAg; the positive rate of PreS2-Ag and LP  were higher than that of the HBeAg. No significant differences were  found in the positive rates between LP and the levels of HBV DNA and  there was a positive correlation between quantitations of HBV DNA and  HBV-LP. Conclusion Serum PreS1-Ag, PreS2-Ag and LP were laboratory  markers that can accurately reflect HBV DNA reproduction, and were  helpful complementarity to traditional HBV M. There is a close  correlation between the number of copies of HBV DNA and the levels of  HBV-LP

[Key words]  Hepatitis B; Hepatitis B virus ;Hepatitis B,antigens;Viral envelope proteins;Genetic marks 

乙型肝炎是影響人類健康的主要傳染病之一，其不僅感染率高，而且易于慢性化，引起肝硬化和原發性肝癌。HBV為嗜肝DNA病毒，含有3200個核苷酸，含有4個開放讀碼框架，編碼6種蛋白，其中S基因編碼3種外膜蛋白，包括主蛋白（即HBsAg），中蛋白（即HBsAg和Pre-S2蛋白）和大蛋白（即HBsAg、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白）^[1]。近年來隨著對HBV外膜蛋白在乙型肝炎發病機制、感染與病毒復制等方面研究的深入，研究者們逐漸認識到了其具有越來越重要的臨床意義，如Pre-S1抗原能夠反映HBV的復制情況，可以作為預測干擾素治療是否有效的指標，推測急、慢性乙型肝炎的預后情況，并可用于制備重組乙肝疫苗等^[2]。目前臨床上習慣以HBeAg來判斷乙肝病毒復制及傳染性強弱。但是當乙肝病毒發生前C與C區變異后，會出現HBeAg陰性，而病毒仍復制的情況，造成臨床難以確定停藥時機及治療結束后應答持續時間短等情況的出現^[3]。為探討乙肝患者血清中HBV PreS1-Ag、PreS2-Ag、PreS1-Ab及LP檢測的臨床指導意義及其與HBV DNA水平的關系，本研究對201例慢性乙型病毒性肝炎患者的HBV DNA、HBV M、PreS1-Ag、PreS2-Ag、PreS2-Ab及LP進行了檢測分析。

1 材料和方法

1.1 材料  隨機選取解放軍第三○二醫院2002年6月至2006年3月乙肝患者血清201份，標本均于-80℃保存。HBV Pre-S1抗原檢測、HBV Pre-S2抗原檢測、HBV DNA實時熒光聚合酶鏈反應（PCR）定量檢測及HBV M檢測試劑盒分別購自上海阿爾法生物技術有限公司、北京肝炎試劑研制中心、達安基因公司和北京科衛試劑公司，檢測HBV-LP的單克隆抗體由熱景生物技術有限公司饋贈。

1.2 方法

1.2.1   HBV Pre-S1 Ag、Pre-S2 Ag、HBV DNA、HBV M及HBV-LP的檢測：均嚴格按試劑盒操作說明進行。

1.2.2   統計學方法：采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。各種檢測指標陽性率的比較均采用X²檢驗，HBV-LP含量與HBV DNA的拷貝數的相關性分析采用頻數表的相關與回歸分析。

2 結果

2.1  PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg陽性率比較

血清檢驗結果見表1。統計分析表明4種外膜蛋白檢出陽性率差異有統計學意義（X²=72.57，P=0.00＜0.01），進一步統計分析表明PreS1-Ag、PreS2-Ag檢測的陽性率差異無統計學意義（X²=3.81，P=0.05＞0.01），同時LP與HBsAg檢出陽性率差異也無統計學意義（X²=4.89，P=0.03＞0.01）。

表1  血清PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg、HBeAg檢測結果

Tab .1 Detection of serum PreS1-Ag,PreS2-Ag,LP and HBsAg

2.2  PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg陽性率比較

統計分析表明PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP、HBsAg檢出陽性率差異有統計學意義（X²=53.80，P=0.00＜0.01），進一步統計分析表明PreS1-Ag與HBeAg檢測的陽性率差異無統計學意義（X²=2.36，P=0.12＞0.01），但PreS2-Ag、LP檢出陽性率均高于HBeAg（X²=12.18，P=0.00＜0.01；X²=50.58，P=0.00＜0.01）。

2.3  PreS1-Ag、PreS2-Ag、LP與HBV DNA陽性率的比較

檢測結果見表2。統計分析表明PreS1-Ag、PreS2-Ag與HBV DNA檢測陽性率差異有統計學意義（X²=51.57，P=0.00＜0.01；X²=32.36，P=0.00＜0.01），但LP與HBV DNA檢測陽性率差異無統計學意義（X²=3.86，P=0.05＞0.01）。

 表2 前S1、前S2、大蛋白陽性率與HBV DNA陽性率的比較

Tab. 2  The relationship between PreS1-Ag,PreS2-Ag,LP and HBV DNA 

2.4 HBV-LP與HBV DNA的相關性 

HBV DNA拷貝數的對數值與HBV-LP定量值的相關系數r=0.902，回歸方程為Y=1.604+0.501X（P＜0.05），這一結果說明HBV DNA拷貝數的對數值與HBV-LP定量值具有正相關關系，HBV DNA拷貝數的對數值變化可以用HBV-LP定量值為解釋變量的線性回歸模型來推導。 

3  討論

乙肝病毒感染人體后，在血清中存在形式主要有三種，即大球形顆粒（Dane顆粒）、小球形顆粒和管形顆粒。前S1抗原、前S2抗原只在Dane顆粒上表達，前S1抗原由108~110個氨基酸殘基組成，其21~47位氨基酸為肝細胞膜受體。前S2抗原含有55個氨基酸殘基，其C端與表面抗原N端相連，其N端109~133位氨基酸為聚合人血清蛋白受體^[4]。因此，二者可作為乙肝病毒感染復制的指標。但通過研究鴨乙肝病毒發現，含有嗜肝病毒血清的感染性不僅依賴于具有感染性Dane氏顆粒的多少，而且還依賴于缺乏核酸的亞病毒顆粒（SVPs，subviral particles，包括管狀顆粒和小球顆粒）的數量，該亞病毒顆粒在HBV感染過程中，能顯著增強細胞內的病毒復制和基因表達，而這種增強作用是由pre-S蛋白的反式激活作用所觸發的^[5]。還有研究發現，在HBV形成包膜的過程中需要大蛋白（即HBsAg、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白）和中蛋白（即HBsAg和Pre-S2蛋白）的參與^[6,7]，因此除了檢測HBsAg外，Pre-S蛋白的存在對于臨床判定HBV復制具有一定意義。

本研究對目前較常用的HBV外膜前蛋白檢測指標（包括Pre-S1、Pre-S2及大蛋白）進行了相關性研究，同時比較了它們與HBV M的關系及其在判定HBV DNA復制中意義。結果顯示，在外膜蛋白中HBsAg與LP的陽性率高于Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白，同時Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白陽性率差異無統計學意義。這一結果表明單獨的PreS1或PreS2蛋白的檢測僅能部分反應HBV外膜蛋白在血清中的表達狀態。其原因可能與試劑盒包被單抗針對抗原表位有關，Pre-S1、Pre-S2蛋白檢測試劑盒僅僅針對線性表位，但是編碼Pre-S蛋白的LP Pre-S區具有較為復雜的拓撲結構^[6]，便可能是導致Pre-S1及Pre-S2抗原的檢出率低于LP的原因。進一步研究表明PreS1-Ag與HBeAg檢測的陽性率差異無統計學意義，而PreS2-Ag、LP檢出陽性率均高于HBeAg，提示外膜蛋白是對HBeAg檢測的有益的補充，尤其對選擇壓力導致HBV前C/C變異后HBeAg終止表達的患者更有意義。

雖然目前醫學界認為外周血HBV DNA是HBV復制最直接和可靠的指標，可以用來判定患者和攜帶者有無傳染性，但如前所述HBV DNA的檢測無法反應SVPs的存在與載量。我們研究也證明了這一推斷，在DNA陰性的患者中存在著Pre-S1、Pre-S2抗原及LP陽性的病例。但統計分析發現Pre-S1、Pre-S2抗原檢出的陽性率低于HBV DNA，這可能與ELISA方法檢測的靈敏度有關。進一步的分析表明LP與HBV DNA的陽性率差異無統計學意義，同時經回歸檢驗證明HBV DNA拷貝數的對數值與HBV-LP定量值具有正相關關系，由此可見，HBV-LP在反應病毒復制方面是一個較好的指標，可以部分作為HBV DNA的替代及補充檢測指標。并且Pre-S1、Pre-S2及LP陽性可能是肝內病毒繼續復制和抗病毒治療不徹底的標志，但是對于這一結論還需要進一步研究。 

 參考文獻

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