不常見革蘭陰性菌的快速鑒定方法

  病原學檢測對于感染性疾病的診斷和治療非常重要，因此，臨床微生物實驗室在醫院感染治療和控制中起到關鍵作用。目前，大部分臨床微生物實驗室采用商品化的鑒定系統鑒定臨床分離的細菌，但是對于一些臨床不常見的細菌，傳統的鑒定方法(如革蘭染色、生化反應等)更加實用有效。因此，本文參照CLSIM32-A2文件列舉了一些臨床不常見細菌的特征和鑒定方法，希望對臨床微生物實驗室的常規工作有所幫助。

        一.不常見革蘭陰性菌

        1.布氏桿菌屬

        布氏桿菌屬是一類革蘭陰性細小桿菌，牛、羊、豬等動物最易感染。人類接觸帶菌動物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布氏桿菌病廣泛分布世界各地，我國部分地區曾有流行。布氏桿菌屬分為羊、牛、豬、鼠、綿羊及犬布氏桿菌6個種，20個生物型。中國流行的主要是羊、牛、豬三種布氏桿菌，其中以羊布氏桿菌病最為多見。

        布氏桿菌屬細菌為非抗酸性，無芽胞，無莢膜，無鞭毛，呈球桿狀(見圖1)。血瓊脂(BAP)上為透明或半透明、光滑且有光澤菌落。此細菌不在麥康凱瓊脂上生長。布氏桿菌屬細菌尿素陽性，觸酶、氧化酶陽性，而吲哚陰性。由于該菌屬細菌具有強的傳染性，因此一旦懷疑應送往LRNB級參考實驗室進行確認。

        2.空腸彎曲菌

        空腸彎曲菌是一種人畜共患病病原菌，可以引起人和動物發生多種疾病，并且是一種食物源性病原菌，認為是引起全世界人類細菌性腹瀉的主要原因。其致病因素包括粘附、侵襲、產生毒素和分子模擬機制等四個方面，通過分子模擬機制可以引起最嚴重的并發癥一格林一巴利綜合征。空腸彎曲菌可以通過產生細胞緊張性腸毒素、細胞毒素和細胞致死性膨脹毒素而致病。空腸彎曲菌對紅霉素、新霉素、慶大霉素、四環素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感，但近年發現了不少耐藥菌株及多重耐藥性菌株。

        空腸彎曲菌菌體輕度彎曲似逗點狀。菌體一端或兩端有鞭毛，運動活潑，在暗視野鏡下觀察似飛蠅。有莢膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2.5～5%氧和10%CO2的環境中生長最好，在正常大氣或無氧環境中均不能生長，最適溫度為37～42℃。本菌在普通培養基上難以生長，在凝固血清和血瓊脂培養基上培養36小時可見無色半透明毛玻璃樣小菌落，單個菌落呈中心凸起，周邊不規則，無溶血現象。空腸彎曲生化反應不活潑，不發酵糖類，不分解尿素。可還原硝酸鹽，氧化酶和觸酶為陽性。能產生微量或不產生硫化氫，甲基紅和v-p試驗陰性，枸椽酸鹽培養基中不生長,在彎曲菌中馬尿酸呈陽性反應具有重要鑒定價值。

        3.“HACEK”群細菌

        HACEK是指一組革蘭陰性桿菌：嗜血桿菌屬(H)、放線桿菌屬(A)、人心桿菌屬(C)、艾肯菌屬(E)、金氏桿菌屬(K)。這組微生物的共同特征是易導致心內膜感染，約占全部感染性心內膜炎的5-10%，它們是導致正常人群(非靜脈藥物濫用者)心內膜炎的常見原因之一。所有這些微生物都是口咽部正常菌群的一部分，生長緩慢、喜好富二氧化碳環境。除心臟瓣膜感染，HACEK菌還導致其他感染：菌血癥、各類膿腫、腹膜炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、化膿性關節炎、骨髓炎、尿路感染、傷口感染、腦膿腫、牙周感染。

        嗜血桿菌屬因在生長過程中需含有生長因子X(氯化高鐵血紅素)和(或)V(輔酶Ⅰ)的血液瓊脂而得名。本屬細菌為革蘭陰性小桿菌，無動力，具有明顯的多型性，不形成芽胞，需氧或兼性厭氧。流感嗜血桿菌是嗜血桿菌屬最重要的病原菌，鏡下呈球桿狀、長桿狀、少數為絲狀。粘液型菌株有莢膜，毒力較強。菌落一般為光滑型，若與金黃色葡萄球菌在BAP上共同孵育，則在葡萄球菌菌落周圍生長的流感嗜血桿菌菌落較大，這叫做“衛星現象”。原因是金黃色葡萄球菌能合成較多的V因子，促進流感嗜血桿菌的生長。

        放線桿菌屬為革蘭陰性桿菌，有時呈球形、橢圓形(見圖3)。兼性厭氧菌，無動力，無莢膜，在含血清或血液的培養基上生長良好，37℃培養2～3天后形成直徑約1mm的菌落。在肉湯培養液中生長呈顆粒狀。對人或動物致病的有伴放線放線桿菌、林氏放線桿菌和馬駒放線桿菌。伴放線放線桿菌因常見于人類的某些放線菌病的病灶中而得名。但也可單獨致病，如一些亞急性細菌性心內膜炎是由本菌引起的。本屬細菌能還原硝酸鹽，不產生吲哚，尿素陽性。

        人心桿菌是心桿菌屬內唯一的種，是人的鼻腔和咽喉部的正常菌群，可引起心內膜炎、尿路感染、腦膿腫和牙周炎等疾病。大部分菌株可從血液中分離而來，有的菌株也可從腦脊液中分離而來。人心桿菌為無鞭毛、無莢膜、無芽孢，并具有多形性的革蘭陰性桿菌(見圖4)。革蘭染色不易被脫色，單個存在或成對排列，有時形成短鏈或呈葡萄狀排列。該菌為兼性厭氧菌，某些菌株在初代分離時需要CO2，在生長過程中要有一定濕度，在干燥環境中不生長；在35～37℃均可生長，但在22℃或42℃均不生長。該菌在BAP上不溶血，經24h培養后菌落很小，48h后可達1mm，菌落為圓形、凸起、光滑、有光澤而邊緣整齊，某些菌株的菌落可長入培養基中，使培養基表面瓊脂凹陷。麥康凱瓊脂上不生長。人心桿菌氧化酶陽性，觸酶陰性，吲哚陽性，不還原硝酸鹽。

        嚙蝕艾肯菌是革蘭陰性多形性球桿菌(見圖5)，有一種漂白劑的氣味，兼性厭氧，是口腔和許多其他粘膜表面的正常菌群。嚙蝕艾肯菌是人咬傷后發生的蜂窩織炎的病原體，它也是已發現靜脈藥物濫用者軟組織感染和心內膜炎主要病原體。它也能導致各種各樣的肺部感染(如膿胸、肺炎、敗血癥栓子)，類似嚴格偏性厭氣菌。

        大多數嚙蝕艾肯菌性心內膜炎患者有潛在的生物瓣膜病變。與其他HACEK菌不同，大多數嚙蝕艾肯菌性心內膜炎與靜脈藥物濫用有關。嚙蝕艾肯菌在培養基上凹陷生長，吲哚陰性，鳥氨酸陽性。

        金氏桿菌屬是革蘭陰性球桿菌(見圖6)，有3個種：

        金氏金氏桿菌、產吲哚金氏桿菌、去硝化金氏桿菌，只有金氏金氏桿菌引起心內膜炎。與其他HACEK菌不同，金氏桿菌感染進展相當迅速。金氏金氏桿菌在BAP呈大的、光滑、不透明、白色或米色、β-溶血菌落，與腸桿菌科細菌相似，但在麥康凱瓊脂上不生長。金氏金氏桿菌觸酶陰性，氧化酶陽性，通常分離自無菌組織和體液。

        4.土拉熱弗朗西斯氏菌

        土拉熱弗朗西斯氏菌簡稱土拉弗氏菌，是引起土拉弗氏菌病(野兔熱)的病原菌。人類感染此病多因接觸患病動物而致，或攝食污染食物和吸入污染空氣所致。土拉桿菌是革蘭陰性多形性細菌，鏡下呈球狀、桿狀、豆狀和絲狀等，無芽胞、無動力、有莢膜。該菌營養要求較高，在普通瓊脂培養基和肉湯中均不生長，只在加入

        胱氨酸、半胱氨酸、血液或卵黃的培養基中生長，形成圓形、光滑、灰色、凸起、有粘性的菌落，在雞胚絨尿膜上也能生長，在卵黃囊中生長尤為茂盛，最適生長溫度35℃～37℃。若從動物或人體初次分離，一般需要3—5天。常用培養基主要有半胱氨酸葡萄糖血液瓊脂平板(Francis培養基)、卵黃瓊脂平板和半胱氨酸巧克力瓊脂。土拉熱弗朗西斯氏菌氧化酶陰性，觸酶陰性或弱陽性，β-內酰胺酶陽性。由于該菌具有強傳染性，必須在生物安全柜中處理，一旦懷疑需送往LRN參考實驗室進行確認。

        5.卡他莫拉菌

        卡他莫拉菌為革蘭陰性雙球菌。過去一直認為卡他莫拉菌是對人體無致病性的上呼吸道正常寄居菌，但是，近20多年的研究發現，該菌不僅可以引起兒童和老年人的上呼吸道感染，而且還是引起成人下呼吸道感染的重要病原菌，是兒童上頜竇炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常見致病菌，僅次于流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。卡他莫拉菌在BAP上不溶血，整個菌落可推動，氧化酶、觸酶陽性，丁酸鹽、吲哚酚醋酸鹽陽性。

        6.奈瑟菌屬

        奈瑟菌屬細菌為革蘭陰性球菌，單個或成雙排列，無芽孢、無鞭毛、有菌毛，觸酶、氧化酶陽性，包括腦膜炎奈瑟菌(見圖7)、淋病奈瑟菌等9種，其中有臨床意義的致病菌為腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌。BAP上呈透亮不溶血菌落，氧化酶、γ-谷氨酰氨肽酶陽性為腦膜炎奈瑟菌。BAP上呈淺灰色不溶血菌落，氧化酶、β-半乳糖苷酶陽性為乳糖奈瑟菌。淋病奈瑟菌在巧克力瓊脂上呈小的、有光澤的菌落，通常在BAP、MH和胰大豆瓊脂上生長，氧化酶陽性，觸酶強陽性(30%過氧化氫)，而γ-谷氨酰氨肽酶、β-半乳糖苷酶陰性。

        表1不常見革蘭陰性菌的快速鑒定方法