不同作物不同發育時期過氧化物酶同工酶的比較分析

一、原理

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在催化劑過硫酸銨（AP）和加速劑四甲基乙二胺（簡稱TEMED）的作用下，聚合而成的具有三維網狀結構的凝膠，通過改變聚丙烯酰胺單體的濃度和交聯度可以控制凝膠孔徑的大小。通過改變催化劑的用量，可以控制凝膠聚合的速度。本實驗采用不連續的電泳體系。以聚丙烯酰胺為支持物，采用電泳基質的不連續體系，即凝膠孔徑的不連續性、緩沖液離子成分的不連續性、pH的不連續性和電泳過程中自動形成的電位梯度的不連續性，使樣品在不連續的兩相之間積聚濃縮成很薄的起始區帶（約10 ^-2 cm），然后再根據電荷效應和分子篩效應進行分離。

二、實驗材料、 儀器 及試劑

1、材料：水稻芽 水稻幼苗 灌漿期的葉片 小白菜葉片 玉米葉片萌發4-5天的小麥芽

2、 儀器 ：電泳儀 電冰箱 20×20（厘米）玻璃板一塊

20×20（厘米）凹形玻璃板一塊 玻璃注射器：

10毫升×1支 微量注射器 ：100微升1支

小燒杯2個 研缽1個 小白瓷盤 1個

3、 試劑

G 過硫酸銨 0.56克 ， 用水定容至100毫升，一般現用現配

F 蔗糖40g加水溶解定容至100mL。

E 電極緩沖液：

H 顯色溶液：1. 稱0.25克聯苯胺溶解在18毫升冰醋酸中，用水稀釋至100mL；

2．3%H ₂ O ₂

I 固定液：7%的醋酸溶液

J 前沿指示劑：0.1%溴酚藍水溶液

三、操作方法

1、粘板：取一塊20×20（厘米）的玻璃板，在板的左、右、下三方邊緣處用馬鈴薯淀粉糊將三塊20×1.5（厘米）的有機玻璃條分別粘合，然后再蓋上一塊20×20（厘米）的凹型玻璃板。這樣有機玻璃條被夾在兩塊玻璃板之間，以便留下灌膠的空隙，用鐵夾夾緊固定在一有機玻璃的支架上，檢查是否漏水（漏水則要重新粘板）。

2、灌膠：⑴下層膠的配制：將A、C、G、水以1：2：1：4的比例混合配制24ml于小燒杯中，馬上灌入兩玻璃板之間，（高度約為板的三分之二）然后用注射器在膠面上加一層水，使下層膠面平整。待凝膠聚合后，傾去水層，再用吸水紙輕輕吸干。

⑵上層膠的制備：將B、D、G、F以1：2：1：4比例配8毫升灌注入下層膠上，高約為2-4厘米，立即插入一有機玻璃的梳狀物，待上層膠凝固以后，取出梳狀物，上層膠中即形成若干個凹形間隔（此間隔即是點樣孔）。

3、電泳槽安裝：將制好的板，從支架上取下，用鑷子小心撥去下方的有機玻璃條，將靠凹形玻璃板一面與電泳槽粘合，用鐵夾固定。

4、樣品的制備和點樣：⑴樣品制備：取① 2克萌發1-2天的水稻芽；② 2克水稻幼苗；③ 2克灌漿期的葉片；④ 2克小白菜葉片；⑤ 2克玉米葉片；⑥2克萌發4-5天的小麥芽。剪碎后，分別放在研缽中，各加入5毫升稀釋5倍的電極緩沖液，磨成勻漿后在6000轉/分下離心5分鐘，取上清液2ml加入等體積40%蔗糖混合，用微量注射器吸收100微升點入上層膠各間隔中，再加入1滴蔗糖。向上、下槽注滿電極緩沖液，再在上槽加2滴溴酚藍作前沿指示劑，將上槽接上負極，下槽接上正極，打開電源開關，調節電流約12mA，半小時后，將電流增至24mA。待前沿指示劑到距板下至1厘米左右時， 關閉電源，停止電泳。

5、取膠和染色：將板從電泳槽取下，用鑷子撥去二根有機玻璃條再小心將凹板揭開，將膠片托起放入盛有顯色劑的白瓷盤中，直到可見至清晰的過氧化物酶同工酶棕色譜帶，棄去顯色劑，用 蒸餾 水沖洗 膠片 ，然后，將 膠片 放入70%的醋酸溶液中保存。

四、結果觀察和記錄

五、注意事項

1．粘板一定要粘好，否則會漏膠。

2．電泳時，電流不可太大。太大會燒膠。電泳一般需要放在冰箱中進行，以便于散熱。