一種利用表面等離子共振定量流感病毒的新方法—單向放射免疫擴散法
一種利用表面等離子共振定量流感病毒的新方法——單向放射免疫擴散法
譯自= A novel assay for lnfluenza virus quantification using surfece plasman resanance. Vaccine 2010 Jan8:28(3)759-65
C. Estmer Nilsson 1, S.Abbas1, M.Bennem 1,
A.Lorssan 2, M.D. Hamalalnen 2, A. Frostell Karlssan 2
1 GE Heathcare BioScience AB, Bjorkgatan 30, SE-751 84 Uppsata,Sweden
2 GE Heathcare BioScience AB. Rapsgatan 23. SE-751 84 Uppsata Sweden
利用單向放射免疫擴散法(SRID)來定量血細胞凝集素(HA)，是確保季節性流感疫苗的產品效力的主要方法。本文介紹了一種利用生物傳感器技術定量流感病毒的新方法。此方法通過將HlNl、H3N2和B型病毒的HA蛋白固定在傳感器芯片上，以抑制性分析的形式來定量病毒。初步結粟顯示這種分析與SEID相比，具有具有更高的靈敏度(檢測范圍0.5—10 ug/ml)和更高的精確度，并且能顯著降低了分析及手工操作時間。
簡介
流感病毒疫苗的接種是降低季節性流感死亡率的基本策略。在開發和生產過程中流感疫苗的抗原含量主要是利用免疫化學法定量血細胞凝集素(HA)來確定的。單向放射免疫擴散法(SRID)其中最常用也是最重要的方法。自1978年以來，美國食品藥品監督管理局(FDA)批準的所有人滅活流感病毒疫苗的效力加的效力都是用SRID來確定的。同時，它還是世界衛生組織(WHO)和歐洲藥品管理局(EMEA)的推薦方法[1-3]。然而，除了非常耗費勞力，這種方法還有一些其它缺陷，如準確性低、精確度和靈敏度也低[4]。
到目前為止，流感疫苗主要是利用雞胚來生產的。然而，對流感病毒新近爆發的恐慌讓人們著手利用細胞門著手利用細胞培養來更有效地生產疫苗。這種工藝開發急需新的靈敏而簡單的分析工具。
目前已有多種不同的針對流感病毒的定量和檢測方法見諸報道：酶聯免疫吸附分析(ELISA)[5-7]。神經氨酸酶(NA)活性分析[8,9]，HPLC法[10-12]，血凝分析[11,13]，以及定
量PCR(qPCR)[14-16]。其中一些方法與SRID相比，靈敏度有所提高。然而，除了多重定PCR，這些方法都不能減少手工操作時間，也不能在單個實驗中同時定量三種不同亞型的HA。然而，鑒于qPCR必須經過將RNA轉化成DNA的反轉錄步驟，因而相比起定量qPCR更適合用于流感病毒及分型上。Williams等[17]展示了一種液相色譜串聯質譜技術聯合同位素稀釋，用于病毒蛋白的絕對定量。此方法的優勢在子能在一個實驗中分析三價疫苗，而且降低了對參照抗原和血清的需求量。然而，由于確定HA濃度的獨立參考標準無法得到，也就無法與SRID測定進行直撞的比較。此外，這個方法還需要在分析前制備樣品[17]。
過去也有利用表面等離子共振(SPR)來檢測并定量流感病毒的報道，這些全是基于直接的結合方法[18-25]。這些研究要么測定HA與它的唾液酸受體結合的動力學[20,22]，要么測定抗體與HA和NA的親和力[18,19,21]。或者描述HA的RNA適體（aptamer）篩選[23]。其中一篇報道介紹了在處理樣品和疫苗中定量流感病毒的方法[25]。這種方法利用唾液酸型化臺物作為多種病毒株通用的弱親和力配體，分析范圍在10-100 ug/ml。它利用了持續的弱親和力生物傳感方法來避免了再生的需要，并減少了分析時間[25]。小型化的生物傳感器也經過
禽流感病毒檢測的測試，特定抗原的檢測極限在5 ug/ml[26]。盡管這些基于SPR的方法縮短了手工操作時間，但它們并不比SRID更靈敏，也無法同時分析三種病毒株。
在此我們介紹一種新方法，利用表面等離子共振以抑制分析的形式準確定量流感病毒。重組的HA蛋白[27](分別為A/H1N1,A/H3N2和B)固定在傳感器芯片的葡聚糖基質上，隨后讓病毒抗原和血滴混合液中針對三種流感類型特異的游離抗體與表面的HA蛋白結合，產生響應的變化(圖1)。樣品中病毒濃度越高，殘余抗體結合響應就越低。重組HA蛋白固定在同一塊芯片表面的三個不同流動槽內，這樣就能在同一實驗中分析三價疫苗。研究表明生物傳感器分析是可靠的．與SRID相比回收率、精確度和靈敏度更高，而分析時間更短。校準曲線范田是0.5-10 ug/ml,所有三種亞型(A/H3N2、AHlNl和B)的檢測極限預計低子0.5 ug/ml。由于此方法中的參照抗原和血清與當前疫苗效力檢測方法中所使用的相同。這種新方法有可能取代或者補充SRID，成為未來的流感疫苗的定量方法。