抗氧化劑在癌癥的發生和發展中的角色越來越有爭議，越來越多的證據顯示不同的抗氧化劑在不同類型的癌癥進程中，既有可能會起到積極的預防作用，又或者會加速癌癥的發展。盡管不能全盤否認抗氧化劑在預防腫瘤方面積極的作用，該不該使用抗氧化劑以及如何使用，都給人們造成了相當的困擾。第二軍醫大學近日于《Hepatology》發文指出，在原發性肝細胞癌的發生進程中，靶向線粒體或非靶向線粒體的抗氧化劑具有相當不同的作用。兩種類型的抗氧化劑通過影響ATM/ATR的活性，調控DNA的損傷修復，對原發性肝細胞癌的發生發展起到了截然不同的作用，為相關的藥物治療提供了新思路。本研究的RNA -seq實驗部分由伯豪生物助力完成。
研究思路
研究結果
1.非靶向線粒體的抗氧化劑促進修復DNA損傷，抑制原發性肝細胞癌（HCC）的發生和發展，而靶向線粒體的抗氧化劑促進肝癌的發生和發展
通過注射DEN造成原發性肝細胞腫瘤的患病小鼠，分別飼喂兩種類型，非靶向線粒體和靶向線粒體的抗氧化劑。飼喂非靶向線粒體NAC的小鼠，其腫瘤大小約為對照組的四分之一，相比而言，腫瘤生長得到了顯著抑制。飼喂線粒體靶向型抗氧化劑SS31的HCC小鼠與對照組相比，腫瘤顯著增大。相似的實驗結果同時由另外兩種抗氧化劑，線粒體靶Trolox和線粒體靶向型抗氧化劑MitoQ證實。
由DEN和CCl4共同作用造成的HCC更接近于人類病癥，本研究中同時在DEN和CCl4共同作用產生的HCC小鼠模型上進行了相同的抗氧化劑處理，結果與DEN處理患病小鼠一致。
2.轉錄測序實驗揭示兩種類型抗氧化劑處理后氧化還原反應，以及DNA損傷應激反應相關基因表達量顯著變化
對DEN 和CCl4共同處理造成的HCC小鼠，分別飼喂線粒體靶向和非線粒體靶向的兩種類型的抗氧化劑處理后，進行轉錄組測序實驗。與PBS處理對照組相比，GO功能分析顯示，氧化還原反應相關的基因，表達量發生了顯著變化，這表明小鼠體內的氧化還原反應狀態可能對于HCC的發生發展起到了重要影響。RNA-seq實驗揭示，差異基因在DNA損傷應激反應相關通路顯著富集。NAC和SS31引起的氧化還原狀態以及DNA損傷反應中很不相同。
在諸多關注的氧化還原反應相關因子中，細胞色素P450家族中的CYP4A10，CYP4A14，LBP1以及CBR1四個基因表達有顯著差異，表現為經NAC處理表達量顯著減少，經SS31處理表達量顯著增加，測序結果通過qPCR實驗驗證。同時，免疫熒光試驗顯示，CYP4A10在經NAC處理后顯著減少，而經SS31處理后，積累顯著增加。
3. SS31加劇DNA損傷程度，而NAC處理促進修復DNA損傷
對DNA損傷marker 8-OHdG，以及DEN誘發產生的丙二醛（MDA）進行免疫組化實驗，經SS31處理后，DNA損傷標記物顯著積累，而在NAC處理后顯著降低。同時，脫嘌呤或嘧啶（AP）位點在肝組織的分布經SS31以及NAC處理后也發生了顯著變化。這些結果暗示了氧脅迫mtROS可能在DNA損傷中起到的重要作用。
DDR、組蛋白（H2AX）、p53結合蛋白（P53BP1）、BRCA1在DNA損傷的應激反應中都起到了關鍵作用，而SS31處理使這些因子的表達顯著降低，NAC促進這些蛋白的表達。有意思的是，細胞凋亡和半胱氨酸蛋白酶caspase-3 和多聚 (ADP-核糖)聚合酶PARP，細胞凋亡相關因子額表達僅在NAC和Trolox處理后表達顯著提升，而經線粒體靶向的抗氧化劑處理后表達無顯著變化。
4. NAC和Trolox通過激活ATM/ATR，減緩DNA的損傷修復。而SS31和MitoQ會通過抑制ATM/ATR活性，加劇DNA的損傷程度
細胞中ATM和ATR的編碼基因具有較高的同源性，均具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性, 作用下游靶蛋白相應絲氨酸或蘇氨酸位點。在細胞周期調控、DNA損傷識別和修復中處于關鍵位置。DNA發生損傷后，ATM/ATR是氧化應激反應的中心。一些因素，如DNA損傷或者ATP，會促使ATM發生自身磷酸化，處于激活狀態p-ATM。
在由DEN誘發的肝細胞癌小鼠模型中，NAC和Trolox處理后，pATM/pATR表達明顯上升，并且pATM/pATR的下游重要底物 p-CHK1 and p-CHK2也顯著增加。相反地，經SS31處理后，，pATM/pATR表達顯著下降。
不同類型的抗氧化劑對于ATM的影響，提示我們ROS產生位置的不同，可能會對DNA損傷造成不同的影響。經SS31處理后，p-ATM在線粒體內積累增加，而在細胞核中積累顯著降低。相反地，經NAC處理后，p-ATM在線粒體內積累顯著降低，而在細胞核中顯著增加。另外，免疫熒光實驗表明，NAC處理后，ATM在細胞核區域大量積累，而SS31引起ATM在線粒體周圍的明顯積累。
5.在體內和體外實驗中，施用ATM阻斷劑后，由DEN誘發的DNA的損傷情況都發生了加劇
用ATM的抑制劑VE-822阻斷ATM發揮作用，由DEN誘發的DNA損傷加劇，效果與NAC處理相抵消。相反地，用ATR/ATM 激活劑能夠促進修復DNA損傷，其效果與SS31處理造成的效果相抵。相一致的實驗結果在由DEN誘發的肝細胞癌小鼠模型中也得到證實。
研究結論
在由DEN誘發的肝細胞癌小鼠模型中，NAC和Trolox能夠通過激活ATM/ATR，減緩DNA的損傷修復。而相反地，SS31和MitoQ會通過抑制ATM/ATR活性，而加劇DNA的損傷程度。當部分恢復由SS31清除的線粒體ROS后，SS31引起的DNA損傷也會得到緩解。不同類型抗氧化劑對HCC造成的相反的影響，可能的解釋是，是由線粒體和非線粒體產生的ROS在肝癌發生初始時期的發揮的作用不同，線粒體內產生的不平衡ROS可能會誘發基因毒素引起的基因損傷，進而造成腫瘤的生成。
原文出處
Wang B, Fu J, Yu T, Xu A, Qin W, Yang Z, Chen Y, Wang H. Contradictory effects of mitochondria -and non-mitochondria-targeted antioxidants on hepatocarcinogenesis by altering DNA repair. Hepatology. 2017.
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