《科學》子刊：首次證實，新冠病毒S蛋白竟是溶酶體蛋白

　　新冠疫情爆發至今已經三年，雖然奧密克戎致病性有所減弱，但新冠病毒仍在快速變異，而變異主要集中在S蛋白。因此，破解S蛋白核心變異對新冠病毒進出細胞的影響，對新冠病毒溯源、抗體療法、疫苗設計尤其重要。

　　近日，由約翰·霍普金斯大學醫學院Stephen Gould教授領銜的研究團隊，在著名期刊Science Advances發表重要研究成果【1】。該論文的第一作者是郭晨栩，通訊作者是Stephen Gould，其他研究人員包括蔡尚睿、Yiwei Ai、Maggie Li、Eduardo Anaya、Andrew Pekosz和Andrea Cox。

　　通過研究新冠病毒S蛋白在細胞內的轉運，Gould團隊發現S蛋白是一種溶酶體蛋白，2020年初出現并迅速占據主導地位、成為所有毒株共有的D614G突變并不是對人類宿主的適應。相反，D614G的出現糾正了由早期弗林蛋白酶切割位點插入（FCSI）突變所引起的一系列S蛋白功能缺陷，包括S蛋白向溶酶體的運輸。

　　Gould團隊2020年底曾在預印平臺biorxiv上刊登過相關研究結果【2】，是世界首篇提供明確證據表明S蛋白能夠重塑溶酶體結構和功能的論文，進一步支持以溶酶體為核心的β冠狀病毒進出細胞的機理模型，并揭示了D614G突變作為基因內抑制因子，在新冠病毒進化、免疫、預防、治療等方面的重要意義。

　　S蛋白是抗擊新冠病毒最關鍵的蛋白質，因為它識別并介導受體結合，促進病毒進入細胞，依然是絕大多數疫苗的唯一抗原和抗體療法的首要目標，而且它還一直在快速變異。

　　不同于其他SARS相關冠狀病毒，新冠病毒在其起源之時或之前獲得了FCSI突變，使S蛋白能被弗林蛋白酶介導的加工預先激活，以便其他絲氨酸蛋白酶如TMPRSS2進行切割，為新冠病毒提供了一種新的、不依賴于胞內體/溶酶體的入侵機制去感染細胞，從而使新冠病毒能夠通過呼吸系統快速、有效地傳播。

　　盡管FCSI增加了新冠病毒可以采用的感染機制、可以識別的受體范圍、可以感染的細胞類型以及可以傳播的途徑和效率，但也引起了S蛋白結構的顯著變化。由于改變結構的變異幾乎總會伴隨一些不利的副作用，FCSI會帶來有害的特性也就不足為奇了。具體而言，FCSI導致內體/溶酶體感染途徑出現重大缺陷，新冠病毒在缺乏TMPRSS2表達的VeroE6等細胞系中復制不良，在連續傳代后，迅速出現FCSI逆轉突變體【3-7】。

　　疫情開始不久，新冠病毒便獲得了另一個有利的變異（D614G突變）。這是新冠病毒在人群中傳播后出現的第一個變異，也是后來所有毒株共同擁有的變異。它顯著增強了新冠病毒的感染力、傳播性和病毒載量，奇點網此前也曾多次報道。

　　一般來說，病毒會朝著減少其細胞表面表達的方向進化，這可能是因為適應性免疫反應定向選擇了能夠更好地逃避免疫監視的突變病毒。為了檢測D614G是否能夠減少S蛋白在細胞膜上的表達，研究人員把新冠病毒原始毒株（WT）和D614G突變株的S蛋白克隆出來，分別整合到一個由四環素操縱子調控的基因表達體系中，并通過兩個不同的對照實驗（生物素細胞表面標記結合親和素親和層析分離，以及細胞表面熒光標記流式細胞術）發現，D614G使細胞膜S蛋白的表達量降低至原來的三成水平，而這兩種S蛋白的總表達量相似。

　　眾所周知，蛋白質在細胞內的轉運是一場零和博弈。鑒于S/WT和S/D614G的總表達水平相似，既然D614G使其在細胞膜的表達量減少了70%，那么它一定是被運輸到了細胞內部。

　　研究人員通過分析早期新冠患者的血漿，利用不同患者產生的抗體，追蹤S蛋白在細胞內的轉運。果然，他們在表達S/WT的細胞中發現了強烈的細胞表面信號，而在表達S/D614G的細胞中找到了更多的細胞內部定位。有趣的是，S/WT顯示出大量與高爾基體標記物GM130熒光共定位，而S/D614G則高度集中在多個大型非高爾基體細胞器中。

　　此前曾有多則報道，β冠狀病毒能將宿主細胞的溶酶體轉化為病毒儲存和釋放的容器，所以新合成的β冠狀病毒顆粒不是通過經典分泌途徑釋放的，而是被運輸到溶酶體并在那里不斷積累，直到被溶酶體胞吐作用大量釋放。

　　為了確定S/D614G高度集中的細胞器是否就是溶酶體，研究人員做了一系列實驗，包括免疫熒光顯微、免疫金電子顯微技術等，證實了（1）S蛋白是一種溶酶體蛋白并能引起溶酶體聚集，（2）D614G將S蛋白從細胞膜重定向到溶酶體限制膜上，（3）與S/WT相比，D614G導致更多的S蛋白（約1.5倍）轉運到溶酶體上。

　　研究人員接下來測試了D614G在新冠病毒感染的情況下，是否也會影響S蛋白在細胞內的轉運。他們分別用原始毒株和D614G突變株感染Vero E6/TMPRSS2細胞，用免疫熒光顯微鏡和流式細胞術等方法分析，得到了相似的結果。

　　至于新冠病毒為什么會發生D614G突變，研究人員認為，該突變出現的時間和重復、獨立的起源表明，它的產生正是為了適應新冠病毒進化歷程中相對較新的事件，而在新冠病毒的近期歷史/史前歷史中只發生了兩起重大事件：由動物傳染到人類，以及新冠病毒特有的FCSI變異。由此推理，D614G出現的原因有兩種可能，一種是對其新宿主人類的進化適應，另一種是為了修正先前FCSI所帶來的不利影響而產生的進化適應。

　　研究人員首先在進化史上距離人類較遠的哺乳動物負鼠的細胞中表達了S/WT和S/D614G兩種蛋白，并測量了S蛋白的總表達量和在細胞表面的表達水平，得出了與之前一致的結論，從而排除了“D614G是人類特有的進化適應”這一可能性。

　　接下來，Gould團隊根據幾組不同的實驗發現，抑制弗林蛋白酶或破壞FCSI，確實恢復了S蛋白向溶酶體運輸的能力，而弗林蛋白酶介導的S蛋白切割，導致S蛋白轉運至溶酶體的功能出現明顯缺陷，并使細胞表面S蛋白的表達量增加約3倍。研究人員認為，D614G通過還原S蛋白向溶酶體運輸的能力，抑制了S蛋白轉運中與FCSI相關的有害特性。

　　在后續的實驗里，研究人員利用遺傳學方法發現，S蛋白向溶酶體的轉運是由其細胞外結構域調節的。此外，Gould團隊基于多個對照試驗，提供了首個明確證據表明，僅僅依靠S蛋白的表達就足以驅動溶酶體聚集、KDEL受體在溶酶體積累、ER駐留蛋白的異常分泌，甚至可能阻斷內吞物質的溶酶體攝取。

　　總的來說，從細胞生物學的角度，Gould團隊首次證實新冠病毒S蛋白是一種溶酶體蛋白，在β冠狀病毒感染的細胞中，除了受體結合、膜融合以外，還能改變溶酶體的結構并重塑溶酶體的功能。

　　從新冠病毒進化的角度，Gould團隊的研究成果表明，最早出現的兩個突變，FCSI和D614G，在功能上是密切相關的。D614G突變的出現是為了修復FCSI引起的不良副作用而發生的進化適應，同時依然允許弗林蛋白酶切割S蛋白并支持新冠病毒在呼吸系統傳播。

　　Gould團隊強調，新冠研究應該拓寬考慮S蛋白突變的遺傳和功能背景，雖然所有S蛋白突變都可能代表對其環境的適應，但也有可能是對先前突變的適應。除了研究S蛋白突變對其受體結合、膜融合催化能力的作用，還應該關注這些突變對S蛋白在宿主細胞內的轉運及其對S蛋白介導的溶酶體重編程的影響。