α-半乳糖苷酶廣泛存在于植物、微生物及動物中，屬于糖苷水解酶第26和37家族。其中，第26家族的α-半乳糖苷酶只來源于真核生物，而第37家族的α-半乳糖苷酶則主要來源于原核生物。
根據酶活和最適pH，α-半乳糖苷酶有酸性和堿性之分。對于植物來源的α-半乳糖苷酶的研究比較多，在植物種子、果實、葉子和塊莖中都發現了該酶，且來源于種子和葉子的多是酸性α-半乳糖苷酶，屬于糖苷水解酶第27家族。堿性α-半乳糖苷酶多具有合成酶作用，且屬于糖苷水解酶第36家族。植物中研究的α-半乳糖苷酶有咖啡豆、無花果、豆芽、椰子、芋頭塊莖、黃瓜、葡萄、水稻、木瓜等；
種子中有大豆、斑豆、蕃茄等；細菌中有鏈霉菌、脆弱芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、發酵乳桿菌、嗜熱絲袍菌、雙歧桿菌等；真菌中有葡酒色被孢霉、根霉、產紫青霉、里氏木霉、煙曲霉、草酸青霉、寄生曲霉、黑曲霉、臭曲霉、分枝犁頭霉、米曲霉等。
在各種哺乳動物組織的勻漿中也存在α－半乳糖苷酶，人和鼠的甲狀腺、腎臟和脾臟酶的活性最高。隨著分離純化技術的發展，得到了越來越多的純化酶，分子生物學的迅速發展也為α-半乳糖苷酶的研究開創了新的領域。通過基因工程技術，人們已經從動物器官、植物、細菌和真菌等生物體中克隆出許多α-半乳糖苷酶基因，許多α-半乳糖苷酶也因其耐熱性而受到越來越多的關注。
來源于布氏棲熱菌的α-半乳糖苷酶能耐受的最高溫度達93 ℃；
從嗜熱脂肪芽孢桿菌分離純化α-半乳糖苷酶的最適溫度為65℃。已研究較多的是具有熱穩定性的α-乳糖苷酶菌株和嗜熱菌、耐熱梭狀芽孢桿菌等。這些從嗜熱或耐熱微生物中獲得的熱穩定α－半乳糖苷酶可解決其應用過程中存在的熱不穩定性問題，對該酶的推廣和使用具有重要意義。